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布 魯 氏 菌 外 膜 蛋 白 (outer membranepro- tein,OMP)16是一種與肽聚糖相關(guān)的保守性脂蛋 白,廣泛存在于布魯氏菌的6個(gè)種屬。本試驗(yàn)表 達(dá)、純化出布魯氏菌 OMP16,并以純化的布魯氏菌 OMP16作為包被抗原,建立檢測(cè)布魯氏菌抗體的間 接 ELISA 法,為布魯氏菌病檢測(cè)及疫苗評(píng)價(jià)等提供 一種靈敏度高的技術(shù)方法。移液器,德國(guó) Eppendorf公司;電子天平,美國(guó) D-I-C 公司;臺(tái)式高速低溫離心機(jī),德 國(guó) Eppendorf公司;PCR儀,北京賽百奧科技有限公 司;核酸電泳儀,美國(guó) Millipore公司;凝膠成像儀, 上海天能科技有限公司;電熱恒溫培養(yǎng)箱,上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠(chǎng);超聲波細(xì)胞粉碎儀,寧波新藝超聲設(shè)備 有限公司;酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀,北京 Bio-Rad公司。
目前最常用的異源蛋白表達(dá)系統(tǒng)是原核表達(dá)系 統(tǒng),因其原核表達(dá)載體帶有篩選和純化標(biāo)簽,方便了 蛋白的純化。但原核表達(dá)載體系統(tǒng)也存在不足之 處,會(huì)出現(xiàn)異源表達(dá)的蛋白與大腸埃希氏菌系統(tǒng)不 相容,蛋白無(wú)法表達(dá),以及表達(dá)的重組蛋白不可溶的現(xiàn)象。 先 后 嘗 試 了 多 種 不 同 的 載 體,如 pGEX-4T-1載體,pET-28a(+)載體,但均出現(xiàn)了重 組蛋白 未 表 達(dá) 的 現(xiàn) 象。最 終 選 用 pET-32a載 體, pET系統(tǒng)是目前 E.coli 表達(dá)重組蛋白最強(qiáng)大的系 統(tǒng)。ELISA 方法受多種因素的影響,首先是抗原抗 體的反應(yīng)條件。根據(jù)抗原抗體反應(yīng)具有特異性、比 例性、可逆性、階段性等特點(diǎn),采用方陣滴定法篩選 抗原抗體最佳的反應(yīng)條件。